E’ un cardinale e arcivescovo cattolico italiano, arciprete della Basilica papale di San Pietro in Vaticano, presidente della Fabbrica di San Pietro e vicario generale di Sua Santità per la Città del Vaticano.
Ordinato sacerdote l’11 marzo 1967, viene dapprima nominato vicerettore nel Seminario diocesano di Pitigliano, quindi nel 1968 è chiamato a lavorare a Roma nella Congregazione per i vescovi e, contemporaneamente, ricopre il ruolo di padre spirituale nel Seminario Romano Minore. Nel 1971 lascia Roma per assumere la direzione del seminario della sua diocesi e nel 1979 diventa parroco di Porto Santo Stefano, all’Argentario, incarico che lascerà undici anni dopo.
Il 25 luglio 1990 è eletto vescovo di Massa Marittima-Piombino. Riceve l’ordinazione episcopale il 12 settembre 1990 dal cardinale Bernardin Gantin (cocon
sacranti: arcivescovo Gaetano Bonicelli, vescovo Eugenio Binini). A causa di un’improvvisa malattia al cuore, nel 1994 ha interrotto con grande sofferenza l’esperienza di pastore di quella diocesi che gli è rimasta sempre particolarmente cara. Ristabilitosi in salute, il 9 novembre 1996 è eletto Delegato Pontificio per la Santa Casa di Loreto. A Loreto ha vissuto una intensa esperienza di accoglienza di pellegrini. Per nove anni consecutivi ha predicato i «Quaresimali», pubblicando poi in altrettanti libri le riflessioni dettate in quelle occasioni. Contemporaneamente è stato nominato presidente della Conferenza episcopale marchigiana, del Comitato per i congressi eucaristici nazionali italiani, del collegamento nazionale dei santuari italiani. È stato nominato anche vicepresidente della Pontificia Accademia dell’Immacolata.
È stato presidente del Comitato italiano del Grande Giubileo del 2000.
Il 5 febbraio 2005, quasi due mesi prima della morte di papa Giovanni Paolo II, viene eletto presidente della Fabbrica di San Pietro. Il 31 ottobre 2006 papa Benedetto XVI lo ha nominato arciprete della Basilica di San Pietro in Vaticano. Sostituisce in questo incarico il cardinale Francesco Marchisano, di 77 anni d’età.
È stato creato cardinale nel concistoro del 24 novembre 2007 da papa Benedetto XVI, ricevendo la diaconia di San Salvatore in Lauro.
È membro della Congregazione per le cause dei santi.
Il cardinal Comastri, che si riconosce come figlio spirituale di Madre Teresa di Calcutta, ha scritto le meditazioni per la Via Crucis presieduta da papa Benedetto XVI al Colosseo nella notte di Venerdì Santo del 2006.
In una occasione, ha predicato gli esercizi spirituali della Quaresima a Giovanni Paolo II e alla Curia Romana. Il presule è vicario generale di sua santità per lo Stato della Città del Vaticano e presidente della Fabbrica di San Pietro dal febbraio 2005, incarichi questi che continuerà a ricoprire. Precedentemente era stato arcivescovo del Santuario Mariano nazionale di Loreto.