È Maestro Perpetuo della Cappella Musicale Pontificia Sistina e Accademico di Santa Cecilia, è noto nel campo musicale, sia come compositore che come direttore.
Considerato tra i più autorevoli interpreti di Giovanni Pierluigi da Palestrina, ha compiuto, con il coro della Cappella Sistina, numerose esibizioni in tutto il mondo; ha anche diretto numerosi concerti con il Coro dell’Accademia nazionale di Santa Cecilia (è da ricordare la tournée nell’ex Unione Sovietica).
Ha inoltre diretto il coro della RAI e i principali complessi sinfonico-corali italiani a Roma, Venezia, Trieste, Palermo, ecc.
Giovanissimo entrò nel seminario fiorentino dove fu reclutato come cantore. Alla morte del suo maestro Bagnoli, gli succedette come direttore della Cappella del Duomo di Firenze. In quegli anni iniziò a comporre le p
rime messe, i primi mottetti, le musiche organistiche, i madrigali e la musica da camera.
Alla fine del 1942 si recò a Roma per approfondire la conoscenza della musica sacra. Dopo aver ricoperto il ruolo di vice Maestro di S. Giovanni in Laterano, nel 1947 divenne Maestro della Cappella Musicale Liberiana di Santa Maria Maggiore come successore di Licinio Refice, assente. Nel 1952, su indicazione di Lorenzo Perosi, fu nominato Maestro sostituto della Cappella Sistina. Morto Perosi nel 1956, Pio XII gli conferì l’incarico di Direttore Perpetuo della Cappella Musicale Pontificia "Sistina". In quegli anni viene inciso il 33 giri "Missa Papae Marcelli" Pierluigi da Palestrina. Etichetta Cappella Sistina CS. Stereo CS001 e "Cappella Sistina" di Domenico Bartolucci. "Cantica". Etichetta Cappella Sistina. CS stero CS002 ambedue gli album sono realizzati da Umberto Iacolucci, grafico romano. Stampa: Campi Grafica di Foligno. Nel 1997 fu sostituito - contravvenendo quindi la nomina papale a perpetuità - alla guida della Sistina da mons. Giuseppe Liberto, evento che destò alcune controversie nel contesto della musica liturgica: verosimilmente si volle optare per un’innovazione dello stile che più si confacesse alle celebrazioni di massa care a Giovanni Paolo II, e della cui regia era responsabile monsignor Piero Marini, maestro delle celebrazioni liturgiche pontificie, a detta di molti tra i responsabili dell’accantonamento di Bartolucci. Tra coloro che più avversarono la decisione fu il cardinale Joseph Ratzinger, il quale, divenuto Papa richiamò Bartolucci a dirigere un concerto nella Cappella Sistina il 24 giugno 2006, nel quale ha offerto musiche del repertorio della polifonia sacra di Giovanni Pierluigi da Palestrina, accanto a proprie composizioni tra cui il mottetto a 6 voci "Oremus pro Pontifice nostro Benedicto" dedicato al Papa.
Il complesso della Cappella Musicale Pontificia "Sistina", alla morte di Perosi versava in precarie condizioni. La situazione fu risanata anche grazie all’impegno di Bartolucci e all’interessamento personale di Giovanni XXIII. Nei 40 anni della sua direzione le esecuzioni durante le liturgie papali si alternano a tournée in vari Paesi (Austria, Germania, Irlanda, Francia, Belgio, Olanda, Spagna, Isole Filippine, Australia, Canada, Stati Uniti, Turchia, Polonia, Giappone). Negli anni del Concilio Vaticano II Bartolucci, contrario all’abbandono del latino, si impegnò affinché la riforma liturgica non prendesse un indirizzo ostile nei confronti della musica sacra. I suoi riferimenti in campo musicale furono la tradizione polifonica palestriniana e il canto gregoriano.
Bartolucci si è dedicato anche all’insegnamento e alla composizione. Il corpus di opere già pubblicate supera i quaranta volumi e comprende Mottetti, Madrigali, Messe, Laudi, Inni, musiche sinfoniche, organistiche e da camera, e soprattutto una serie di oratori per soli, coro e orchestra. È da menzionare anche il Brunellesco, un’opera lirica in tre atti ancora mai eseguita.
La concezione della musica per Bartolucci si fonda sul "dire" con naturalezza e spontaneità rifuggendo astrattezze e astruserie. I suoi punti di riferimento sono il canto gregoriano, Palestrina e Verdi. Caratteristica di tutta la concezione estetica del compositore è quella di un ossequio alla tradizione, alla cui base colloca «una notevole severità di canto e quella limpida e solida polifonicità» indicate nella prefazione del suo Primo Libro dei Mottetti.
Nel concistoro del 20 novembre 2010 papa Benedetto XVI lo ha elevato alla dignità cardinalizia, all’età di 93 anni, 6 mesi e 13 giorni. Si tratta del cardinale nominato più anziano di sempre nella storia della Chiesa Cattolica. Gli è stata assegnata la diaconia dei Santissimi Nomi di Gesù e Maria in via Lata. È uno dei cardinali di Santa Romana Chiesa che ha celebrato la messa tridentina dopo la riforma liturgica.